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夾心法ELISA實(shí)驗(yàn)之檢測(cè)白介素8
lL-8是一種分子量為8～10kD的多肽，對(duì)嗜中性粒細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞、嗜鹼性粒細(xì)胞具有趨化作用，并可激活嗜中性粒細(xì)胞，是一種重要的炎癥介質(zhì)。在嚴(yán)重感染病人的血清中、炎癥局部滲出液中都可檢測(cè)到高水平的IL-8。此外，近年來(lái)的研究表明，IL-8可能與各種組織缺血后再灌注損傷的發(fā)生有關(guān)。我們采用兩株自制的單克隆抗體建立了夾心法ELISA用于檢測(cè)IL-8，敏感性可達(dá)156Pg/ml，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性良好，可用于IL-8的基礎(chǔ)和臨床研究。
一、原理
采用兩株識(shí)別不同表位的抗IL-8單克隆抗體，其中一株(4D7)作為包被抗體，以識(shí)別和結(jié)合待檢標(biāo)本中的IL-8,另一株作為酶標(biāo)抗體，與結(jié)合于包被抗體的IL-8的另一個(gè)表位結(jié)合并催化底物顯色。
二、試劑器材
1. 試劑盒提供包被抗體、酶標(biāo)抗體、標(biāo)準(zhǔn)品，底物(ABTS)、96孔elisa板。
2. 包被緩沖液、PBS、底物緩沖液配制同常規(guī)ELISA法。
三、操作步驟
1. 包被：pH9.5 碳酸鹽緩液稀釋4D7單克隆抗體粗提γ球蛋白至1μg/ml,加入96孔板,100μl/孔，放4℃,36小時(shí)。
2. 封閉：0.1%吐溫PBS(Buffer A)沖洗96孔板三次，加3%BSA Buffer A(Buffer B)200μl/孔，放37℃,1小時(shí)。
3. 加待檢樣品：Buffer A 沖洗96孔板三次，加待檢樣品及Buffer B 稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品100μl/孔，放37℃,3小時(shí)。
4. 加酶標(biāo)抗體：Buffer A沖洗96孔板五次,3%PEG Buffer A稀釋酶標(biāo)抗體至1∶800，加入96孔板，100μl/孔，放37℃,1小時(shí)。
5. 顯色：Buffer A沖洗96孔板五次，pH5.4檸檬酸緩沖液溶解底物(ABTS),0.2mg/ml,加3%H2O2,2μl/ml，加入96孔板，100μ/孔，室溫下或37℃顯色。
四、注意事項(xiàng)
1. 待檢標(biāo)本如為血清，應(yīng)采用一次性容器，血液采集后盡快(6小時(shí)以內(nèi))分離血清。
2. 封閉液或抗體稀釋液應(yīng)新鮮配制或凍存。
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