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實(shí)驗(yàn)筆記｜ELISA實(shí)驗(yàn)“花板”了怎么辦?
酶聯(lián)免疫的原理是抗原或者抗體的固相化及抗原抗體的酶標(biāo)記，加入酶反應(yīng)底物后，底物被徹底催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定量或定性的分析。實(shí)驗(yàn)的特異性和靈敏度較高，操作也簡(jiǎn)單，可大批量操作而廣泛應(yīng)用于多種傳染病的篩查。然而，由于「花板」現(xiàn)象的出現(xiàn)，會(huì)給實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判讀和分析帶來(lái)麻煩。「花板」，就是空白、陽(yáng)性、陰性對(duì)照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而樣本孔的 OD 值偏高，弱陽(yáng)性的結(jié)果偏多。以下，是關(guān)于花板原因的一些分析。
1、花板的原因大多在在樣本
花板，就是空白、陰陽(yáng)性對(duì)照及室內(nèi)質(zhì)控空結(jié)果正常，而樣本孔 OD 值偏高。之所以空白、對(duì)照及質(zhì)控孔的結(jié)果正常而樣本孔的結(jié)果異常,是因?yàn)闃颖颈旧淼脑?，大部分或者全部的樣本孔?nbsp;OD 值偏高，很可能是因?yàn)闃悠分心承┕灿械奈镔|(zhì)非特異性的吸附于固相載體，而在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中并未除去。
2、洗滌的作用
聚苯烯因其具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能而被廣泛用于 Elisa 實(shí)驗(yàn)的固相載體，聚苯烯塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附作用是具有普遍性，因此需要通過(guò)洗滌排除在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的非特異性地吸附在固相載體上的干擾物質(zhì)。
3、孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)造成花板現(xiàn)象
樣本過(guò)多會(huì)導(dǎo)致樣本在室溫停留時(shí)間增多，進(jìn)而加長(zhǎng)了孵育的時(shí)間，蛋白質(zhì)非特異性吸附于固相載體。
為了避免“花板”問(wèn)題的出現(xiàn)，降低檢測(cè)的假陽(yáng)性率，獲得更理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)采取下列措施：
1.在選擇ELISA試劑時(shí)，應(yīng)選擇靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性好、批間差小、操作方便、省時(shí)的試劑,如恒遠(yuǎn)生物高敏elisa試劑盒。
2.在所有標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)的過(guò)程中，所用的儀器及加樣過(guò)程都處于正常狀態(tài)的情況下，步驟均按照各種試劑說(shuō)明書(shū)的要求去做，排除實(shí)驗(yàn)所用儀器和操作步驟對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。
3.血液標(biāo)本應(yīng)置于室溫下1-2h，使血液凝固收縮，然后離心檢測(cè)或讓血液過(guò)夜后再檢測(cè)。這樣才能使得血液充分收縮，讓標(biāo)本中的非特異性物質(zhì)所致的假陽(yáng)性率降至低。
4.檢測(cè)加大離心轉(zhuǎn)速，盡量延長(zhǎng)時(shí)間，使血細(xì)胞和纖維蛋白充分沉淀，讓血細(xì)胞與血清徹底分離。
5.加樣時(shí)不能加入紅細(xì)胞或纖維蛋白，要按照操作說(shuō)明書(shū)去做，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
6.對(duì)于血清中存在的紅細(xì)胞或纖維蛋白原，可以在加樣離心時(shí)得到控制，同樣也可以通過(guò)適當(dāng)增加洗滌次數(shù)和浸泡時(shí)間來(lái)進(jìn)步減輕或避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。同樣，對(duì)于血液存在的非特異性的IgG，增加洗滌次數(shù)和延長(zhǎng)浸泡時(shí)間也同樣有效。
7.封板溫育時(shí)，各孔定要封嚴(yán)，防止陽(yáng)性標(biāo)本的液體蒸發(fā)，產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn)。
8.孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，增加了固相載體吸附非特異性蛋白的可能性，也會(huì)造成“花板”。因此，除把握孵育時(shí)間外，在加樣過(guò)程中也應(yīng)嚴(yán)格控制時(shí)間，標(biāo)本較多時(shí)可分批操作。
9.手工洗板時(shí)應(yīng)注意液體被濺出或孔與孔之間的液體溢出，連成整體液面后產(chǎn)生“花板”。
10. 用洗板機(jī)洗板時(shí)應(yīng)防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過(guò)程中易產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn)。
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